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本制品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real-Time PCR的一种2×浓度的预混型试剂，适合Real-Time PCR的Buffer组合，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，适合进行高灵敏度的Real-Time PCR扩增反应。本制品适用于快速Real-Time PCR扩增反应，可以在宽广的定量区间内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确的定量检测，重复性好，可信度高。

本制品预先混有热启动Taq DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I荧光染料、稳定剂和镁离子等通用组分，只需加入模板、引物、双蒸馏水便可进行Real Time PCR反应，操作简单方便。本品内含Low ROX Reference Dye，适用于需要校正孔间荧光信号误差的仪器。

• 使用前，请上下轻轻颠倒混匀，避免产生气泡，防止因混合不均匀造成反应效果不佳。
  
  • 请勿涡旋振荡混匀。
    
  • 2×SYBR qPCR预混液(低ROX)在-80℃存放可能会产生白色或淡黄的沉淀，用手握缓慢溶解，于室温短时间避光放置，轻柔上下颠倒混匀直至沉淀全部消失。
    
  • 沉淀会导致溶液成分不均匀，使用前务必充分混匀试剂。
• 配制反应液时，试剂请于冰上放置。
  
• 本制品中含有荧光染料SYBR Green I，配制PCR反应液时避免强光照射。
  
• 反应液的配制、分装请一定使用新(无污染)枪头、Microtube等，避免污染。
  
• 本制品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 配置反应体系：
  建议的模板量为10～100ng (基因组DNA)或1～10ng (cDNA模板)。推荐使用反转录试剂盒合成DNA模版，以有效去除RNA样品中残留的基因组。按下表配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)。
  

  成分	20μL体系	50μL体系	终浓度
  ×SYBR qPCR预混液(低ROX)	10μL	25μL	1×
  PCR Forward Primer (10μM)	0.4μL	1μL	0.2μM
  PCR Reverse Primer (10μM)	0.4μL	1μL	0.2μM
  DNA模板	2μL	4μL
  ddH2O	7.2μL	19μL
  总体积	20μL	50μL

  • 通常引物终浓度为0.2μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0μM范围内调整引物浓度。
    
  • 在20μL反应体系中，DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定合适的DNA模板添加量。
    
  • 按照各仪器推荐体系进行反应液配制。
• 进行Real-Time PCR反应
  建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。

  两步法PCR反应					三步法PCR反应
  步骤	温度	时间	循环数		步骤	温度	时间	循环数
  热启动	95℃	5min	1		热启动	95℃	5min	1
  变性	95℃	10sec	40		变性	95℃	10sec	40
  退火/延伸	60℃	30sec			退火	55～60℃	20sec
  熔解曲线	95℃	15sec	1		延伸	72℃	20sec
  	60℃	60sec			熔解曲线	95℃	15sec	1
  	95℃	15sec				60℃	60sec
  						95℃	15sec

  • 预变性时间：根据不同模版和引物的具体情况可适当缩短至2min；
    
  • 退火温度和时间：根据引物和目的基因的长度进行调整；
    
  • 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。